酵母展示——篩選高親和力靶向膜蛋白抗體
膜蛋白，如離子通道和G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs），是藥物發(fā)現(xiàn)的重要靶點(diǎn)，但針對(duì)這類靶點(diǎn)的特異性抗體和多肽的開發(fā)和優(yōu)化常常面臨挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的篩選方法受限于抗原的呈現(xiàn)方式和篩選效率。論文“A cell–cell interaction format for selection of high affinity antibodies to membrane proteins”中，研究者結(jié)合了酵母展示技術(shù)和FACS（fluorescence-activated cell sorting）篩選技術(shù)，闡述了基于細(xì)胞間相互作用捕獲膜蛋白特異性抗體的方法。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)在于：1.省去了復(fù)雜且繁瑣的膜蛋白純化步驟；2.更好的保持了膜蛋白的生理構(gòu)象；3.能夠選擇性的篩選出結(jié)合胞外段的抗體。
實(shí)驗(yàn)方法：
如圖1所示，首先，研究者構(gòu)建了表達(dá)EGFP的酵母展示庫，以及表達(dá)目的膜蛋白和mCherry的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；第二步，將酵母細(xì)胞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞共培養(yǎng)；第三步，利用流式細(xì)胞分選儀分選出具有EGFP和mCherry雙熒光信號(hào)的酵母-哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)合物；第四步，擴(kuò)增培養(yǎng)第三步獲得的酵母細(xì)胞。將以上四步循環(huán)進(jìn)行3到5輪，富集得到能夠與表達(dá)在細(xì)胞膜表面的膜蛋白特異結(jié)合的酵母株。
圖1. 利用酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞之間的細(xì)胞間相互作用進(jìn)行抗體等的篩選示意圖
應(yīng)用實(shí)例1——膜蛋白抗體的親和力成熟
ASC06是human acid-sensing ion channel 1a (hASIC1a)的抑制型抗體，研究者構(gòu)建了ACS06的CDR3區(qū)的突變文庫，并制備了酵母展示庫，按照?qǐng)D1所示流程進(jìn)行了5輪篩選，在第4輪篩選后，陽性雙熒光信號(hào)從初始文庫的 0.075% 增加到 3.16%，表明高親和力抗體得到了富集（圖 2A）。在五輪選擇之后，分離并測(cè)序了 100
個(gè)克隆，發(fā)現(xiàn)了兩種主要的突變類型：YF取代原始DSFYGYSKGD序列中的FY（41個(gè)克?。┖蚏A取代YS（19個(gè)克隆）。通過表面等離子體共振 (SPR) 測(cè)量這些抗體與hASIC1a的親和力（圖 2C）。結(jié)果顯示，與野生型相比，兩種突變體的親和力增加了兩到三倍（從0.28 nM野生型到0.10 nM ASC03 和0.12 nM ASC28）。研究者還通過在不同濃度抗體存在下使用電壓敏感染料通過熒光成像板讀數(shù)器 (FLIPR) 測(cè)量膜電位來確定抗體的IC50。與野生型抗體相比，兩種突變抗體表現(xiàn)出更好的IC50，表明它們?cè)谝种扑嵴T導(dǎo)的hASIC1a電流方面具有提高的效力（圖 2D）。
圖2. 靶向hASIC1a抗體ASC06的親和力成熟和富集克隆的表征。(A) CHO/hASIC1a-mCherry細(xì)胞混合物與初始酵母文庫(R0)或第4輪富集后的酵母文庫(R4)的FACS分析結(jié)果；(B) 經(jīng)過五輪篩選后測(cè)序的100個(gè)克隆的H-CDR3的WebLogo圖，以顯示H-CDR3內(nèi)每個(gè)位置的氨基酸分布；(C) SPR測(cè)量抗體ASC03、ASC06和ASC28的親和力譜圖，原始數(shù)據(jù)用彩色線表示，黑線是擬合曲線；(D) 抗體ASC03-IgG1、ASC06-IgG1和ASC28-IgG1抑制酸誘導(dǎo)hASIC1a電流的IC50。
應(yīng)用實(shí)例2——靶向人μ-opioid receptor (hMOR)抗體的發(fā)現(xiàn)
GPCR是重要的藥物靶標(biāo)，但使用既定方法制備針對(duì)這些跨膜蛋白的特異性抗體一直頗具挑戰(zhàn)性，這主要是因?yàn)殡y以以正確的構(gòu)象呈遞抗原。研究者將人源scFv天然酵母庫與過表達(dá)人類 GPCR μ-opioid receptor (hMOR)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞孵育。進(jìn)行了四輪篩選以富集靶向hMOR-mCherry過度表達(dá)細(xì)胞的抗體，并對(duì)30個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序以分析富集情況（圖 3A）。挑選了三個(gè)富集度最高的序列進(jìn)行進(jìn)一步表征，其中兩個(gè)克隆表現(xiàn)出特異性結(jié)合（圖 3B）。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)顯示，Ab3和Ab17的親和力分別為76 nM和280 nM（圖 3C）。
圖 3. 靶向hMOR-mCherry過表達(dá)細(xì)胞的抗體篩選及陽性抗體的表征。(A)對(duì)與hMOR-mCherry過表達(dá)CHO細(xì)胞孵育的初始文庫(R0)和經(jīng)過三輪篩選(R3)后的文庫進(jìn)行FACS分析；(B)FACS分析Ab3和Ab17與野生型CHO細(xì)胞和hMOR過表達(dá)CHO細(xì)胞的結(jié)合情況；(C)利用免疫熒光鑒定Ab3和Ab17的親和力。
小 結(jié)
靶向膜蛋白（例如離子通道蛋白和GPCR）的抗體具有重大應(yīng)用價(jià)值的同時(shí)也伴隨著較高的開發(fā)難度。酵母與哺乳動(dòng)物細(xì)胞互作的篩選方法繞過了膜蛋白純化步驟，能夠直接富集靶向天然狀態(tài)下的“難以純化的膜蛋白”的抗體，也可以應(yīng)用于抗體的親和力成熟改造中。
本期參考文獻(xiàn)：
Yang, Zhuo, et al. "A cell–cell interaction format for selection of high-affinity antibodies to membrane proteins." Proceedings of the National Academy of Sciences 116.30 (2019): 14971-14978.
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