選擇合適的技術(shù)路線會讓整個實驗過程事半功倍，少走彎路，一般來說要遵循幾個基本的原則：最根本的一點是要能滿足實驗需求，例如研究一個人源蛋白，對其活性或者翻譯后修飾要求很高，那就首選哺乳動物表達系統(tǒng)，或者只需要簡單 Western Blot 驗證，那大腸表達就能滿足需求；二是經(jīng)濟性及時效性，一般來說大腸表達最快、成本也最低，哺乳動物表達成本較高，時間也較長；三是技術(shù)熟練度及其他需要考慮的問題。

一、設(shè)計問題

設(shè)計問題常出現(xiàn)在新手中，常見的幾個問題如信號肽未去除、密碼子位移等。成熟蛋白一般是不帶信號肽的，大腸桿菌本身也缺乏處理信號肽的機制，信號肽本身一般也具有較強的疏水性，帶信號肽表達會導(dǎo)致蛋白無活性或大量包涵體等問題，所以一般在原核表達時候會去除信號肽；密碼子移碼主要容易在選擇酶切位點時候出現(xiàn)，比如常見的 Nco I 位點。另外比如稀有密碼子可通密碼子優(yōu)化解決，在蛋白不表達的時候可以嘗試優(yōu)化一下密碼子；序列 GC 含量、蛋白大小等問題都是在設(shè)計時候需要考慮到的問題；純化標簽的選擇，促溶標簽對后續(xù)研究是否有干擾等也需要全面考慮。

二、表達及純化過程中遇到的問題

1、蛋白不表達

蛋白不表達原因很多，大部分情況下可以從下面的幾個方面去調(diào)整排除。通常來說原核表達中小于 10kd、大于 100kd 的蛋白是比較難表達的；質(zhì)粒構(gòu)建好后一定要通過測序確認，仔細比對載體序列及插入序列，確保沒有移碼及突變；檢查表達菌株與質(zhì)粒是否配套，比如Novagen 的 pet 系列載體是 T7 啟動子，配套常用 BL21 及其衍生菌株，Qiagen 的 pQE 系列載體使用的是 T5 啟動子，需要用到 M15 等配套菌株做表達；檢查表達條件是否合適，比如誘導(dǎo)型表達是用誘導(dǎo)劑還是溫度誘導(dǎo)，是否是組成型表達等；培養(yǎng)基的選擇，LB 培養(yǎng)基中不表達，換用富營養(yǎng)的 TB 培養(yǎng)基可能會解決這個問題；也有可能是蛋白表達量太低或者是降解快，必要時需要通過 Western Blot 來確認。

2、純化中常見問題

2.1 包涵體及其復(fù)性 

包涵體在原核中及其常見，通常來說是因為蛋白不正確折疊形成的，原因很多，可能表達過快而來不及折疊，也可能是缺少翻譯后修飾導(dǎo)致不正確折疊，還可能是蛋白本身疏水性強等各種原因，可以通過降低誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑濃度、引入分子伴侶共表達、換專用感受態(tài)等方式來解決，或者包涵體純化后復(fù)性，注意包涵體純化復(fù)性一般是 his 標簽蛋白，常用變性劑為尿素和鹽酸胍，其他純化標簽需要注意是否兼容變性劑。包涵體純化后的復(fù)性是一個世界性難題，并沒有一個通用解決方案，常用的復(fù)性手段有稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、分子篩及離子柱層析等，復(fù)性遵循原則：低溫、低濃度、小梯度，添加劑如 PEG8000、精氨酸等在復(fù)性中也常用到，可在一定程度上提高復(fù)性成功率。

   包涵體
 1：誘導(dǎo)前 ，2：誘導(dǎo)后，3：包涵體，4：上清

2.2 蛋白降解 

降解也是純化中常見的現(xiàn)象，一般是因為細菌本身的蛋白酶引起的，在破胞及后續(xù)的操作中保持低溫及全程添加蛋白酶抑制劑能一定程度上解決降解問題；buffer 中加 5-10%甘油也能起到抑制降解的作用；檢查蛋白序列，可參考 pET 手冊中的 N 端原則，如果 M 后為精氨酸 、賴氨酸、 組氨酸 、苯丙氨酸 、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸或色氨酸等的話可能對蛋白穩(wěn)定性影響較大，盡量避免；也可能是表達提前終止，或者因為密碼子偏好性問題，可換用其他感受態(tài)如 Rosett、OrigamiB 等嘗試；如果真核蛋白翻譯后修飾對蛋白穩(wěn)定性有影響的話需要考慮換用真核表達。

2.3 蛋白純度不高 

純化過程中洗雜并不是每次都能很完美洗去雜蛋白，特別是Ni 柱純化的蛋白，通常雜蛋白較多，需要多種純化方式聯(lián)用，比如離子交換、疏水作用純化、分子篩等。原核表達純化蛋白時候很多時候分子伴侶會跟目的蛋白一起很難分離，可通過離子柱來結(jié)合分子伴侶蛋白而讓目的蛋白直接流過柱子來分離，也可嘗試 Ni 親和層析時候用高鹽 buffer（eg：2M NaCl），很多時候也能達到目的；也可更換表達感受態(tài)，降低表達背景，如 plysS 菌株；標簽聯(lián)用也能有效提高純化純度，并且很大程度上可以減少工作量，例如先用 his 標簽親和層析，再用 flag 標簽做二次純化，因 flag 特異性很強，二次純化能明顯提高蛋白純度，但因其成本較高，flag 等標簽在大規(guī)模純化中不常用。

2.4 SDS-PAGE 條帶與預(yù)測大小不符

由于蛋白表達后存在多種狀態(tài)，電荷分布可能有差異，導(dǎo)致遷移速率有變化，會導(dǎo)致 SDS-PAGE 條帶偏移，復(fù)性后蛋白與變性蛋白比較容易出現(xiàn)大小偏移現(xiàn)象，不同的翻譯后修飾也會導(dǎo)致條帶大小不一樣，比如 Tau 蛋白存在多種異構(gòu)體，同時具有較為復(fù)雜的磷酸化、泛素化、糖基化等等翻譯后修飾，所以可能會出現(xiàn)多條條帶現(xiàn)像（eg：30-80 kDa），原核表達的 tau 與磷酸化 tau蛋白大小就有明顯差異，必要時候可通過 WB 驗證。

以上只討論了體外表達中所遇到的一小部分問題，研究過程中遇到問題時需要大量排查、試錯工作，特別是在面對一個全新蛋白的時候，細心才是成功的關(guān)鍵。