包涵體在原核表達中非常常見，但是沒有一個通用的復(fù)性解決方案，常用的復(fù)性手段有稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、分子篩及離子柱層析等，復(fù)性遵循原則：低溫、低濃度、小梯度，下面我們分享三個蛋白復(fù)性的實例。

1. 細(xì)菌破碎后離心收集沉淀，trisbuffer洗滌包涵體3-5次，跑膠檢測包涵體純度

2. 用5-10ml 6M鹽酸胍（ph1.5）溶解包涵體，室溫攪拌30min-1h，離心去除不溶物；

3. 將溶解后包涵體蛋白快速滴定到4℃預(yù)冷pbs中，緩慢攪拌，過夜復(fù)性，離心去除沉淀；

4. 緩慢加（40%）硫酸銨，3h后離心去沉淀（未完全復(fù)性的蛋白）；加終濃度70%硫酸銨，4℃過夜孵育，離心取沉淀，溶解到5-10ml pbs中即為目的蛋白。
   
   

復(fù)性結(jié)果如下圖所示

圖1.包涵體檢測

泳道1：鹽酸胍溶解包涵體  泳道2：包涵體洗滌后

圖2.蛋白復(fù)性后檢測

1.破胞后洗滌沉淀，沉淀用變性劑buffer（8M脲）室溫溶解3h后高速離心去除沉淀，上清中加入Ni填料，4℃混勻孵育2h；

2.孵育結(jié)束后轉(zhuǎn)移beads至層析柱，依次用不同濃度咪唑Wash buffer沖洗柱子；

3.Elute buffer洗脫蛋白后跑膠檢測純度；

4.包涵體復(fù)性：變性蛋白測濃度后滴定入復(fù)性buffer（ 100 mM Tris–HCl, 0.5M 甘氨酸, 1 mM氧化型谷胱甘肽,10 mM 還原型谷胱甘肽, pH8.0） ，使蛋白終濃度為0.1mg/ml， 緩慢攪拌，4℃復(fù)性反應(yīng)過夜，離心去除沉淀，上清轉(zhuǎn)移到透析袋，pbs透析4h，換液至少2次，濃縮后過分子篩。

復(fù)性結(jié)果如下圖所示

圖3.包涵體純化結(jié)果

泳道1為包涵體溶解后上清，泳道2為包涵體溶解后沉淀，泳道3為20mM洗雜，泳道4為40mM洗雜，
泳道5為60mM洗雜，泳道6為100mM洗雜，泳道7為300mM洗脫，泳道8、9為500mM洗脫

圖4.復(fù)性后檢測結(jié)果

柱上復(fù)性