一、前言

免疫熒光染色（Immunofluorescence staining）是利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，并結(jié)合熒光標(biāo)記物對(duì)組織、細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)蛋白等大分子物質(zhì)進(jìn)行定位和定量分析的實(shí)驗(yàn)方法。這種技術(shù)的特點(diǎn)在于將免疫反應(yīng)的高特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的高靈敏度相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子在亞細(xì)胞水平上的可視化觀察。應(yīng)用方面，免疫熒光染色技術(shù)廣泛應(yīng)用于：基礎(chǔ)生物學(xué)研究：在細(xì)胞生物學(xué)中，主要用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分布、相互作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等；

腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)：免疫熒光技術(shù)可用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中的標(biāo)志物，從而輔助癌癥的診斷和研究；

病原體診斷：免疫熒光技術(shù)可以用于檢測(cè)細(xì)菌、病毒等病原體在組織或細(xì)胞樣本中的存在和分布；

治療效果評(píng)估：近年來(lái)，隨著新型治療方法的發(fā)展，免疫熒光染色被用來(lái)評(píng)估這些療法對(duì)特定靶標(biāo)的影響，例如測(cè)定促炎細(xì)胞因子的變化情況。

總之，免疫熒光染色技術(shù)因其操作相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀且靈敏度高的特點(diǎn)，在科研和臨床領(lǐng)域都有著極其廣泛的應(yīng)用。本文介紹一種既簡(jiǎn)潔又高效的植物細(xì)胞免疫熒光染色方法，以供同行專家及學(xué)者參考和應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)操作流程見圖1（以擬南芥為例，研究葉綠體中蛋白定位）。

圖1.流程示意圖

二、操作步驟

1、切割葉片

將新鮮采摘的葉片用手術(shù)刀片或者鋸齒狀刀片切成細(xì)絲狀，然后立馬放入固定液中，可收集到1.5ml ep管中避光固定1-2h?？蛇x固定液配方：0.4 M Mannitol, 20 mM KCl, 20 mM MES (pH 5.7), 4% paraformaldehyde，不同物種或組織滲透壓可能有差異，注意選擇合適的Mannitol濃度。固定后顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，如圖2所示，注意組織盡量切得細(xì)而碎；

圖2.葉片固定效果

2、抗體孵育

將固定后的細(xì)胞收集在EP管或小試管中，1 x PBS清洗三次，每次5min。在清洗后的樣品中加入適量封閉液室溫封閉30min，可選封閉液：含5% BSA和0.15% Triton X-10的 1 x PBS 。加入特定一抗，孵育2h，一抗可直接用封閉液稀釋。用含5% BSA的1 x PBS清洗3次，每次5min。加適量帶FITC標(biāo)簽二抗避光孵育1h，二抗可用含5% BSA的1 x PBS稀釋使用，二抗孵育結(jié)束后用1 x PBS清洗3次；

3、樣品中加適量0.5M EDTA.Na2 (pH 9.0)，55℃水浴1h，結(jié)束后去除EDTA，加入封片劑（5 mM 抗壞血酸鈉、15 mM Na2HPO4 pH 9.0、50% 甘油），可短時(shí)間4℃保存；

4、熒光顯微鏡觀察，觀察時(shí)可用鑷子輕壓、敲擊蓋玻片，使細(xì)胞分散均勻，便于觀察，結(jié)果如圖3所示。

    可選步驟：細(xì)胞壁的存在讓抗體進(jìn)入細(xì)胞困難，可在細(xì)胞固定后制備原生質(zhì)體，得到原生質(zhì)體后再進(jìn)行后續(xù)操作，制備原生質(zhì)體可參考以下操作；

    用含0.5%（W/V）果膠酶和1%（W/V）纖維素酶的1 x TBSTx在37℃酶解1h，倒掉酶解液，用1XTBSTx洗3次，每次10min，注意洗的時(shí)候在搖床上慢搖（10xtbst的配置：24.2gTriis，80gNaCL；用HCL調(diào)節(jié)pH為7.6，定容至1L，加Triton-100使終濃度為1%。）

圖3.結(jié)果示例

免疫熒光實(shí)驗(yàn)是一種常用的生物學(xué)研究手段，它利用不同的標(biāo)記來(lái)實(shí)現(xiàn)多種研究目的。在實(shí)驗(yàn)操作中，需要細(xì)心謹(jǐn)慎，同時(shí)好的抗體也是實(shí)驗(yàn)成功的重要保證。一抗大部分情況下為特別制備抗體，需要在實(shí)驗(yàn)中多次摸索稀釋比例，二抗一般選擇商用FITC二抗，需根據(jù)一抗來(lái)源選擇合適的產(chǎn)品。熟悉原理，操作細(xì)心，一定能得到漂亮的免疫熒光染色照片。

參考文獻(xiàn)：

Wang, L., et al. (2022). "A Tissue-Chopping Based Immunofluorescence Staining Method for Chloroplast Proteins." Front Plant Sci 13: 910569.