一、原理

   
    3-氨基鄰苯二甲酰肼是一種較強的化學發(fā)光物質(zhì)，在辣根過氧化物酶催化的條件下，可以被氧分子氧化成具有發(fā)光現(xiàn)象的中間體，當中間體從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時發(fā)出光子，光子信號可通過X射線膠片或其它化學發(fā)光成像設(shè)備被捕獲。常用于檢測固定在膜上的蛋白質(zhì)等生物大分子。

    HRP（40 kDa）已成為化學發(fā)光WB檢測的常用酶。用于辣根過氧化物酶（HRP）的化學發(fā)光底物常由A、B兩種液體組成；制備工作液時，需要將兩種組分混合在一起。當與結(jié)合有 HRP 標記抗體（或其他探針）的印跡一起孵育時，產(chǎn)生 425nm 的光（如圖1）。發(fā)射光只有在酶 - 底物反應(yīng)期間發(fā)生；因此，一旦酶周圍的底物消耗完畢，信號輸出就會停止，在曝光過程中就會出現(xiàn)“淬滅”的現(xiàn)象，即發(fā)光試劑快速被消耗掉，在幾秒鐘內(nèi)發(fā)強光，又在幾秒鐘內(nèi)迅速消逝，導(dǎo)致發(fā)光信號不易被檢測到。

圖1 ECL化學發(fā)光原理示意圖

      因此，欲得到條帶清晰、背景干凈的可靠WB結(jié)果，WB最后的檢測步驟至關(guān)重要，由于長期使用某一種發(fā)光試劑，科研者多關(guān)注抗體因素對WB結(jié)果的影響，但是ECL化學發(fā)光試劑盒的優(yōu)劣也直接影響實驗結(jié)果。就抗體而言，需要保證其合適的使用濃度及特異性；對發(fā)光試劑，可以選擇靈敏度高，發(fā)光穩(wěn)定的試劑盒，康體生命的超敏 ECL 化學發(fā)光底物檢測試劑盒（KTSM 125）靈敏度高、發(fā)光穩(wěn)定，配合康體生命的重組納米抗體（HRP標記）使用（如：Anti-Flag VHH HRP，KTSM1318），效果更佳，如圖2，條帶清晰可見，背景干凈無雜。

圖2 KTSM ECL化學發(fā)光試劑盒（KTSM 125）操作步驟，Lane 1 : Escherichia coli lysate mock transfected；Lane 2: Escherichia coli lysate transfected with C-Terminal Flag tagged protein vector；Lane 3 : Escherichia coli lysate transfected with N-Terminal Flag tagged protein vector；Lane 4 : Purified Flag tagged protein.

二、常見的問題解決方案

1、熒光淬滅

ECL發(fā)光液發(fā)光不穩(wěn)定，更換優(yōu)質(zhì)ECL發(fā)光試劑盒（如KTSM 125）。優(yōu)質(zhì)的發(fā)光液還可以呈現(xiàn)出較低的背景，得到的數(shù)據(jù)也更可靠、漂亮。

反應(yīng)體系中的HRP過少，增加HRP標記物的量。

操作時間過長，蛋白膜干掉，整個實驗過程保證蛋白膜的濕潤。

2、高背景

鐵離子與ECL發(fā)光液中3-氨基鄰苯二甲酰肼作用會發(fā)出藍紫色熒光，所以在WB實驗中避免使用金屬鑷子，以及生銹刀片、剪刀等裁剪轉(zhuǎn)印后的膜。

封閉不完全，常選用5%BSA或脫脂奶粉，可適當增加封閉時間，對于含有生物素-親和素系統(tǒng)的反應(yīng)體系應(yīng)避免使用脫脂奶粉封閉，因為脫脂奶粉中含有少量生物素。

抗體特異性不好，選用高質(zhì)量的抗體（如康體生命重組納米抗體）。

抗原上樣量過多，減少蛋白上樣量。

洗滌不充分，ECL發(fā)光前一步的洗滌步驟要充分。

3、膜上出現(xiàn)棕色條帶 

說明反應(yīng)體系中的HRP過量，稀釋HRP標記物。

4、蛋白條帶弱

樣品蛋白豐度低，建議加大上樣量。

發(fā)光液的靈敏度低，更換優(yōu)質(zhì)發(fā)光液，以提高條帶亮度。

曝光時間太短，做實驗的過程中加陽性對照，優(yōu)化出合理的曝光時間。