1. 采血后整個細胞分離過程要盡可能快速完成。兩個小時內(nèi)完成實驗一般能夠達到比較理想的分離效果。所以不建議一次分離太大體積的血液。

2. 分離細胞前首先要稀釋血液樣品，因為全血中的紅細胞會發(fā)生聚集，一些PBMC會被包裹進去，與紅細胞一起沉淀。通過稀釋血液可以降低這種趨勢，提高PBMC的回收量。淋巴細胞的產(chǎn)量和純度在很大程度上取決于紅細胞去除效率，所以稀釋的步驟非常重要。

3. 蔗糖密度梯度離心的步驟，制動力度要降低甚至關閉，可以減少細胞分層界面的擾動。

4. 離心的溫度一般在18-22度之間。溫度提高（例如37度），紅細胞更容易聚集，并且把PBMC包裹在里面一起沉淀下來。溫度降低（例如4度），紅細胞聚集速度會降低，但是細胞分離的時間會增加，也會降低淋巴細胞的產(chǎn)量。

5. 離心的時間長短，取決于管內(nèi)血液樣品的高度，樣品高度越大，需要的離心時間也就更長。我們常用的實驗條件是每支50ml離心管內(nèi)有10ml血液樣品，提前用等體積PBS稀釋混勻后，鋪在20ml的細胞分離液上，每支離心管的總液體體積是40ml，在 1100 xg 離心20 分鐘是比較合適的。離心時間不變的情況下，管中血樣的高度如果增加，紅細胞不容易充分沉淀，就會造成樣品的紅細胞污染。

6. 分離完成后要給細胞計數(shù)。一定體積的血液分離得到的PBMC數(shù)量與羊駝的健康狀態(tài)有關，健康情況差，體重過低的羊駝免疫后，等體積外周血提取得到的PBMC數(shù)量較低。我們的經(jīng)驗是，正常情況下每50ml羊駝血能采集到1x10⁸~2x10⁸個細胞。